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LA ANGIOGÉNESIS, ETAPA CLAVE DE LA REGENERACIÓN TISULAR, ESTÁ MODULADA POR LAS PLAQUETAS. 

 Sarah BERNDT PhD1, Gilles CARPENTIER2, Axel TOLLANCE PhD1,3, Antoine TURZI1 

 1 Regen Lab SA, 1052 Le Mont-sur-Lausanne, Suiza.

2 Unidad de Investigación Gly-CRRET 4397, Université Paris-Est Créteil, Créteil, Francia.

3 Departamento de Cirugía Ortopédica, Hospitales Universitarios y Facultad de Medicina de Ginebra, Ginebra, Suiza .

Resumen

Angiogénesis in vivo y in vitroLa vascularización, tanto en procesos fisiológicos como patológicos, es un proceso multifactorial. Implica una plétora de moléculas y vías de señalización, células en diálogo dinámico e innumerables citoquinas y factores de crecimiento para generar un sistema vascular funcional y estable. Sin embargo, esta vascularización es uno de los requisitos previos para la regeneración tisular, ya que garantiza un suministro continuo de nutrientes y oxígeno. Estas consideraciones se introdujeron en la ingeniería tisular moderna cuando se estudió cada vez más la importancia vital de una red vascular.

El futuro de los enfoques regenerativos combinará inevitablemente las estrategias probadas sobre el terreno de la ingeniería tisular con modernas técnicas biomoleculares en el entorno científico de las células madre y la terapia génica.

El delicado equilibrio entre las propiedades mecánicas, el soporte tisular y la estimulación angiogénica será el centro de la investigación en medicina regenerativa durante los próximos años.

En este trabajo, nos centramos en el uso potencial de preparados derivados de plaquetas (plasma rico en plaquetas [PRP], PRP combinado con ácido hialurónico [PRP-HA] y lisados plaquetarios [PL]) para la angioestimulación controlada.

Palabras clave : angiogénesis, plaquetas, regeneración.

Figura 1.

Mecanismos que regulan la angiogénesis por plaquetas. En la angiogénesis en brote (BA), la privación de nutrientes, la hipoxia y los factores proangiogénicos inducen la activación de las células endoteliales (CE) y el crecimiento vascular, donde las células en punta guían a las células madre altamente proliferativas.

Las plaquetas circulantes pueden contribuir a la AB mediante (1) preservar la integridad vascular uniéndose a la matriz extracelular (MEC) expuesta o a las CE.

Las plaquetas activadas también pueden (2) liberan moléculas angiogénicas y micropartículas plaquetarias (PMP) en proximidad de las CE (adaptado de Roweth y Battinelli, 2024 [5]).

INTRODUCCIÓN: ANGIOGÉNESIS, UNA ETAPA CLAVE EN LA REGENERACIÓN DE TEJIDOS

La angiogénesis, proceso por el que se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya existentes, desempeña un papel crucial en la regeneración tisular. Cuando un tejido se daña o necesita crecer, una vascularización adecuada es esencial para proporcionar los nutrientes, el oxígeno y los factores de crecimiento necesarios para la reparación o el crecimiento tisular [1].
En el contexto de la regeneración tisular, la angiogénesis puede estimularse de diversas formas, como el uso de factores de crecimiento, terapias celulares o materiales biomiméticos. Al fomentar la formación de nuevos vasos sanguíneos, se mejora la vascularización del tejido dañado, lo que acelera el proceso de curación y favorece una regeneración tisular más completa [2].
Comprender y manipular la angiogénesis en el contexto de la regeneración tisular abre el camino a muchas aplicaciones médicas prometedoras, sobre todo en el tratamiento de heridas.
enfermedad vascular y degeneración tisular [3]. Optimizando este complejo proceso biológico, podemos mejorar significativamente los resultados clínicos y promover la salud y el bienestar de los pacientes.
En la angiogénesis, las plaquetas desempeñan un papel crucial al liberar diversos factores de crecimiento y citocinas que favorecen la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya existentes.
Estos factores de crecimiento incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y otras moléculas proangiogénicas [4].
Cuando se produce un daño tisular, las plaquetas se activan y se dirigen al lugar de la lesión. A continuación, liberan estos factores de crecimiento, que estimulan la proliferación y migración de las células endoteliales, favoreciendo la formación de nuevos vasos sanguíneos para la reparación y cicatrización de los tejidos. Las plaquetas también pueden interactuar con otras células implicadas en la angiogénesis, como las células endoteliales y las células inmunitarias, para regular el proceso de forma coordinada.
Comprender el papel de las plaquetas en la angiogénesis es crucial para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a modular este proceso en diversos contextos patológicos, como las enfermedades cardiovasculares, el cáncer y la regeneración de tejidos.
Se están llevando a cabo numerosas investigaciones para dilucidar los mecanismos subyacentes y explotar el potencial terapéutico de los productos derivados de las plaquetas en la modulación de la angiogénesis [5].

MODELOS CULTURALES EN 3D IN VITRO SON HERRAMIENTAS INESTIMABLES PARA ESTUDIAR LA ANGIOGÉNESIS, YA QUE PERMITEN RECREAR CON MAYOR FIDELIDAD EL ENTORNO TRIDIMENSIONAL ENCONTRADO.

Las principales ventajas de estos modelos para estudiar la angiogénesis son las siguientes:

Representación realista del entorno celular
Los cultivos en 3D permiten a las células desarrollarse en un entorno tridimensional más próximo al que se encuentran. in vivoEsto se debe a los diferentes tipos de células presentes y a su interacción con la matriz circundante. Esto favorece una interacción célula-célula y célula-matriz más fisiológica y una expresión génica más fiel, lo que puede dar lugar a resultados más relevantes.
Control preciso de las condiciones experimentales
Los modelos 3D ofrecen la posibilidad de controlar con mayor precisión las condiciones experimentales, como la composición del medio de cultivo, la concentración de factores de crecimiento y la rigidez del sustrato. Esto permite a los investigadores comprender mejor los mecanismos subyacentes de la angiogénesis e identificar los factores que la regulan.

Cultivo celular 2D.

PRESTACIONES

  • - Fácil manejo e imagen
  • -A menudo menor coste
  • - Mayor disponibilidad de líneas celulares
  • - Más adecuado para determinados tipos de análisis celulares, como los ensayos de proliferación celular o de citotoxicidad.

VENTAJAS

  • - Incapacidad para reproducir fielmente el entorno tridimensional del tejido in vivo.
  • - Limitaciones en la representación de la interacción celular y la morfología celular
  • -Menos representativo de los fenómenos fisiológicos in vivo
  • -Puede dar lugar a resultados menos predictivos de la eficacia de las terapias.

Cultivo celular 3D

PRESTACIONES

  • - Reproducción más fiel de la arquitectura tisular in vivo
  • - Mejor representación de las interacciones celulares y la morfología celular
  • - Permite estudiar fenómenos biológicos complejos como la angiogénesis y la metástasis
  • -Puede proporcionar resultados más predictivos para la evaluación de fármacos o terapias

VENTAJAS

  • -Aumento de la complejidad de las líneas celulares adaptadas a los modelos 3D
  • -Costes potencialmente más elevados
  • -Menor disponibilidad de líneas celulares adecuadas para modelos 3D.
  • -Aumento del riesgo de no normalización y reproducibilidad de los resultados.
  • - Lleva tiempo
Estudio de la dinámica temporal
Los modelos 3D permiten seguir la evolución de la angiogénesis a lo largo del tiempo, lo que resulta crucial para comprender las distintas etapas del proceso, como la formación, maduración y remodelación de los vasos sanguíneos. También permite estudiar cómo los distintos tipos celulares interactúan y coordinan sus actividades durante la angiogénesis.
Pruebas de fármacos y terapias
Cultivos 3D in vitro pueden utilizarse para evaluar la eficacia de fármacos y terapias dirigidos a la angiogénesis, como los inhibidores de la angiogénesis utilizados en el tratamiento del cáncer o los agentes proangiogénicos utilizados para promover la regeneración tisular. Estos modelos permiten realizar ensayos preclínicos de forma más rápida y económica, al tiempo que reducen la necesidad de utilizar modelos animales.x.
EL MODELO DE MICROESFERAS DE FIBRINA PARA ANGIOGÉNESIS (FBA) ES UNA TÉCNICA DE ANGIOGÉNESIS EN 3D. IN VITRO (Figura 3) [7]
En este modelo, las microesferas o perlas de polímero se recubren con células endoteliales, las células que recubren los vasos sanguíneos.
Figura 3. Pasos en el análisis de la angiogénesis con perlas de gel de fibrina.
  • El primer día consiste en fijar las células endoteliales a un microportador (microesfera).
  • El segundo día se incorporan las microesferas recubiertas a un coágulo de fibrina compuesto por factores de crecimiento y el compuesto de interés, y se siembra una capa de fibroblastos en la superficie del gel.
  • Por último, tras incubarlas durante 48 horas a 37 °C, se tomaron imágenes de las microesferas al cuarto día (adaptado de Clavane et al. 2022) utilizando un microscopio automatizado de alto rendimiento.
A continuación, estas perlas se incorporan a un gel de fibrina, una proteína presente en la sangre que forma un coágulo cuando se activa. Una vez incorporadas las perlas al gel de fibrina, se deposita una capa de fibroblastos sobre los geles de fibrina para que segreguen los factores de crecimiento necesarios para la angiogénesis espontánea.
Se añade un medio de cultivo en el que se diluyen los compuestos de interés a ensayar: en nuestro caso, preparados a base de plaquetas: PRP (RegenPRP), PRP-HA (Cellular Matrix) y lisados de plaquetas (Platelet Max).
Con el tiempo, las células endoteliales proliferarán bajo la influencia de los diversos estímulos proporcionados por los fibroblastos y los factores de crecimiento de los preparados a base de plaquetas.
A continuación, migran fuera de las perlas para formar verdaderos tubos capilares que contienen lúmenes, reproduciendo paso a paso el proceso de angiogénesis observado. in vivo.
En una publicación del grupo Nature© (Carpentier et al, Informe científico 2020) [8Para aumentar la potencia estadística de las cuantificaciones realizadas (Figura 4).
Este modelo, junto con esta nueva cuantificación, proporciona un medio práctico y reproducible para estudiar los mecanismos subyacentes de la angiogénesis y evaluar la eficacia de distintos agentes terapéuticos, como los fármacos antiangiogénicos o los agentes proangiogénicos.
También facilita la visualización de los cambios morfológicos y funcionales de los vasos sanguíneos formados en respuesta a los factores de crecimiento liberados por las plaquetas.
Es una herramienta valiosa para la investigación de la biología vascular y para el desarrollo de nuevas terapias en medicina regenerativa y fisiopatología vascular [...].9].
 

EN NUESTRO ESTUDIO IN VITROEVALUAMOS Y COMPARAMOS LA CAPACIDAD DE TRES PREPARADOS DERIVADOS DE PLAQUETAS

  • Plasma rico en plaquetas (PRP),
  • PRP con ácido hialurónico (PRP-HA)
  • Lisados plaquetarios (PL) a diferentes concentraciones (5-40 %)
Por sus efectos biológicos sobre las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) a nivel de :
  • Su metabolismo,
  • Su viabilidad,
  • Su senectud,
  • Secreción de factores angiogénicos,
  • y las capacidades angiogénicas en 2D (ensayo de formación de tubos endoteliales o EFTA),
  • y 3D (ensayo con perlas de fibrina o FBA) [10] (Gráfico 5).
PRP, PRP-HA y PL inducen diferentes respuestas angiogénicas.
Hemos demostrado que, aunque las tres preparaciones derivan de plaquetas, contienen diferentes mezclas de factores de crecimiento que desencadenan distintas fases del proceso angiogénico en el espacio y el tiempo.
Los PL son potentes estimuladores de la proliferación endotelial, pero de forma no orquestada, lo que dificulta la correcta formación de tubos endoteliales.
Figura 4. Desarrollo de un nuevo método para el análisis morfométrico de la angiogénesis en el modelo de microesferas de fibrina basado en la detección de "árboles vasculares". De [8].
  • A A. Imagen de la muestra inicial que muestra la esfera detectada. B. Gradientes fuertes mejorados y supresión de fondo. C. Umbral "medio". D. Segmentación binaria final. E. Esqueleto de segmentación binaria. F. Esqueleto final tras limpiar el interior de la esfera. Barra de escala: 200 μm.
  • B. Detección de objetos vectoriales en árboles esqueletizados. A.Extremos que son puntos rojos rodeados de amarillo (recuadro 1). B. Detección de ramas (verde) y segmentos (magenta). El recuadro 2 muestra una rama artificial (cian) (por ser demasiado pequeña) que será suprimida por el programa. El recuadro 3 muestra una fusión entre dos uniones cercanas en una sola (borde azul). C. Representación del análisis final, incluidas las uniones de anclaje (púrpura, recuadro 4), que intersecan el límite de la esfera (rojo).

Figura 5. Los productos derivados de las plaquetas modulan la angiogénesis de forma diferente en el ensayo de microesferas de fibrina en 3D.

A. Cultivos 3D de CE humanas (HUVEC) fueron tratados con productos derivados de plaquetas (PRP, PRP-HA y PL) a diferentes concentraciones (5-40 %) durante 4 días. Imágenes representativas de un aumento masivo de la angiogénesis (PRP 20, PRP-HA 20) o de una proliferación endotelial leve a partir de perlas recubiertas de CE (PL20) en comparación con las condiciones de control (control y heparina) en el día 4. Barra de escala: 150 μm.

B. La cuantificación de los parámetros morfométricos de la red capilar se realizó mediante un método informatizado sobre imágenes tomadas el día 4. Los parámetros representativos medidos fueron la longitud total, la longitud total de las ramificaciones, el número de puntas y el número de uniones de anclaje por esfera. Los gráficos son representativos de tres experimentos independientes. Se cuantificaron cien esferas para cada condición experimental. Datos de Berndt et al. Biomedicines. 2021 [10].

El PRP y el PRP-HA que contienen plaquetas vivas inducen la mejor respuesta angiogénica en el complejo modelo 3D FBA, que recapitula todo el proceso angiogénico.
PRP y PRP-HA también pueden tener propiedades antienvejecimiento en HUVECs, ya que se reduce la senescencia endotelial [...].10].
El ácido hialurónico, como hidrogel natural biodegradable, favorece la liberación controlada de los factores de crecimiento del PRP.
El perfil del secretoma explica las actividades biológicas mediante la secreción diferencial de potentes factores angiogénicos cuando las plaquetas se cultivan solas o en presencia de HUVECs.

 CONCLUSIÓN

El PRP solo o combinado con ácido hialurónico es un reservorio de factores de crecimiento que favorece la angiogénesis para aplicaciones de ingeniería de tejidos celulares. in vitro.

Además, los resultados son de gran interés para aplicaciones clínicas en las que se utilizan preparados derivados de plaquetas para terapias angio-regenerativas. in situ para acelerar la cicatrización de heridas y la reparación de tejidos.

REFERENCIAS

  1. Carmeliet , Jain R.K. Angiogénesis en el cáncer y otras enfermedades. Nature 2000; 407: 249.
  2. Mastrullo , Cathery W., Velliou E., Madeddu P., Campagnolo P. Angiogenesis in Tissue Engineering: As Nature Intended? Fronteras de la bioingeniería y la biotecnología 2020; 8: 188.
  3. Azari Z., Nazarnezhad S., Webster T.J., Hoseini S.J., Brouki Milan P., Baino F., Kargozar S. Stem cell-mediated angiogenesis in skin tissue engineering and wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society 2022 ; 30 : 421.
  4. Peterson E., Zurakowski D., Italiano J.E., Jr., Michel L.V., Fox L., Klement G.L., Folkman J. Rangos normales de proteínas reguladoras de la angiogénesis en plaquetas humanas. Revista americana de hematología 2010; 85 : 487.
  5. Roweth G., Battinelli E.M. Platelets and (Lymph)angiogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in medicine 2023; 13.
  6. Nowak-Sliwinska , Alitalo K., Allen E., Anisimov A., Aplin A.C., Auerbach R., Augustin H.G., Bates D.O., van Beijnum J.R., Bender R.H.F., Bergers G., Bikfalvi A., Bischoff J., Bock B.C., Brooks P.C., Bussolino F., Cakir B., Carmeliet P., Castranova D., Cimpean A.M., Cleaver O., Coukos G., Davis G.E., De Palma M., Dimberg A., Dings R.P.M., Djonov V., Dudley A.C., Dufton N.P., Fendt S.M., Ferrara N., Fruttiger M., Fukumura D., Ghesquiere B., Gong Y., Griffin R.J., Harris A.L., Hughes C.C.W., Hultgren N.W., Iruela- Arispe M.L., Irving M., Jain R.K., Kalluri R., Kalucka J., Kerbel R.S., Kitajewski J., Klaassen I., Kleinmann H.K., Koolwijk P., Kuczynski E., Kwak B.R., Marien K., Melero-Martin J.M., Munn L.L., Nicosia R.F., Noel A., Nurro J., Olsson A.K., Petrova T.V., Pietras K., Pili R., Pollard J.W., Post M.J., Quax P.H.A., Rabinovich G.A., Raica M., Randi A.M., Ribatti D., Ruegg C., Schlingemann R.O., Schulte-Merker S., Smith L.E.H., Song J.W., Stacker S.A., Stalin J., Stratman A.N., Van de Velde M., van Hinsbergh V.W.M., Vermeulen P.B., Waltenberger J., Weinstein B.M., Xin H., Yetkin-Arik B., Yla-Herttuala S., Yoder M.C., Griffioen A.W. Directrices de consenso para el uso y la interpretación de los ensayos de angiogénesis. Angiogénesis 2018; 21: 425.
  7. Berndt S., Issa M.E., Carpentier G., Cuendet M. Un papel bivalente de la genisteína en la angiogénesis germinativa. Planta medica 2018; 84: 653.
  8. Carpentier , Berndt S., Ferratge S., Rasband W., Cuendet M., Uzan G., Albanese P. Analizador de angiogénesis para ImageJ - Análisis morfométrico comparativo de los ensayos "Endothelial Tube Formation Assay" y "Fibrin Bead Assay". Informes científicos 2020 ; 10 : 11568.
  1. Clavane M., Taylor H.A., Cubbon R.M., Meakin P.J. Endothelial Cell Fibrin Gel Angiogenesis Bead Assay. Methods Mol Biol 2022; 2441: 321.
  2. Berndt , Carpentier G., Turzi A., Borlat F., Cuendet M., Modarressi A. Angiogenesis Is Differentially Modulated by Platelet-Derived Products. Biomedicines 2021 ; 9.

 

 

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