EVALUACIÓN DEL PLASMA RICO EN PLAQUETAS (PRP) COMO ALTERNATIVA AL SUERO DE TERNERA FETAL (FBS) EN LA EXPANSIÓN DE MIOBLASTOS HUMANOS: UN PROTOCOLO IN VITRO.
Axel TOLLANCE1,3, Diego MICHEL1, Alexandre PROLA2, Axelle BOUCHE1,2, Antoine TURZI3, Didier HANNOUCHE1,2, Thomas LAUMONIER1,2 y Sarah BERNDT3
- 1 Departamento de Ortopedia Cirugía, Ginebra Universidad Hospitales & Facultad de Medicina, Ginebra, Suiza.
- 2 Departamento de Fisiología Celular y Metabolismo, Facultad de Medicina, Ginebra, Suiza.
- 3 Regen Lab SA, 1052 Le Mont-sur-Lausanne, Suiza.
Palabras clave: plasma rico en plaquetas, células madre musculares, expansión celular, regeneración muscular.
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades musculares, ya sean congénitas, adquiridas o degenerativas, representan un importante reto para la salud pública, afectan a la calidad de vida de los pacientes y a menudo provocan una morbilidad significativa.
La regeneración muscular es un proceso complejo en el que intervienen diversas poblaciones celulares, en particular las células madre musculares (MSC), que desempeñan un papel fundamental en la restauración de la integridad y la función musculares tras una lesión [?1, 2].
Sin embargo, en condiciones patológicas como la distrofia muscular de Duchenne (DMD), la capacidad de regeneración muscular se ve comprometida, lo que pone de relieve la necesidad de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para tratar estas enfermedades musculares debilitantes.
CÉLULAS MADRE MUSCULARES Y SU PAPEL EN LA REGENERACIÓN MUSCULAR
Las CMM residen en un estado quiescente entre la fibra muscular y la lámina basal, listas para activarse cuando sea necesario, por ejemplo durante una lesión muscular.
Estas células desempeñan un papel crucial en la regeneración y el crecimiento muscular postnatal, garantizando la integridad y funcionalidad del tejido muscular durante toda la vida. Cuando se produce un daño en el músculo, ya sea como consecuencia de un traumatismo o de una enfermedad, las CMM se activan para responder a la demanda de reparación.
Este proceso implica la activación de las CMM seguida de la proliferación de células progenitoras, conocidas como mioblastos, que luego pueden diferenciarse en células musculares maduras e integrarse en el tejido muscular para restaurar su funcionalidad [...3].
En condiciones patológicas como la DMD, estos procesos de regeneración se ven comprometidos debido a la disfunción de las MSC.
En la DMD, una mutación en el gen de la distrofina causa una degeneración muscular progresiva, que conduce a una función muscular reducida y a una incapacidad para regenerar eficazmente el tejido muscular dañado.
Las MSCs en músculos afectados por DMD muestran una capacidad proliferativa alterada y un potencial de diferenciación reducido, contribuyendo a la progresión de la enfermedad y al deterioro muscular.
TERAPIAS BASADAS EN CÉLULAS MADRE MUSCULARES
Las terapias basadas en CMM han despertado un gran interés como posibles estrategias para la reparación muscular. Las lesiones musculares traumáticas, como roturas o desgarros musculares, podrían beneficiarse de terapias basadas en células madre musculares para acelerar el proceso de curación y restaurar la función muscular normal [...].4, 5]. Mediante la inyección de células madre musculares directamente en la zona lesionada, es posible promover la regeneración tisular y reducir la formación de cicatrices, lo que podría mejorar los resultados clínicos de los pacientes que sufren este tipo de lesiones.
Sin embargo, a pesar de su prometedor potencial, aún quedan varios retos por superar antes de que las terapias con células madre musculares se generalicen en la práctica clínica.
Estos retos incluyen la necesidad de desarrollar métodos eficaces para aislar y cultivar células madre musculares en cantidades suficientes, así como comprender los mecanismos subyacentes a su diferenciación e integración en el tejido muscular dañado.
Una de las principales preocupaciones es la selección y expansión de las células apropiadas en cantidades suficientes para una aplicación terapéutica eficaz [...].6].
En este sentido, la identificación de nuevas fuentes celulares, como las células musculares humanas de reserva (CMRH), representa un avance significativo.
Estas células comparten muchas de las características de las CMM quiescentes y ofrecen un potencial prometedor para la terapia con células musculares.
EXPLICACIÓN DEL MODELO EN VITRO USADO
Para comprender mejor el comportamiento de las células musculares y evaluar la eficacia de nuevas terapias, hemos utilizado un modelo de célula muscular. in vitro basado en células madre humanas primarias.
Primero extrajimos células mononucleares de una biopsia muscular, seleccionamos específicamente las células madre musculares mediante citometría de flujo y luego las dejamos proliferar como mioblastos.
Una vez confluentes, los mioblastos pueden diferenciarse en un medio bajo en factor de crecimiento. Aproximadamente 70 mioblastos % se fusionan para formar grandes células polinucleadas llamadas miotubos, mientras que las células restantes permanecen mononucleadas y adquieren características de células madre.
Estas células se denominan CMRH y son la contrapartida de la in vitro células madre.
Comparten muchas de las características de las MSC, como su estado quiescente, la expresión del factor de transcripción Pax7 y su capacidad para activarse tras la estimulación [...].7].
Figura 1. A. Representación esquemática del proceso de regeneración in vivo. (1) Tras una lesión, las señales adaptadas activan las células madre musculares (MSC) e inducen su migración hacia el lugar de la lesión. Estas CMM activadas vuelven a entrar en el ciclo celular y se denominan mioblastos. (2) Los mioblastos en el lugar de la lesión proliferan hasta alcanzar un número adecuado que permita restaurar el músculo dañado. (3) Los mioblastos se diferencian, detienen su ciclo celular y entran en la fase postmitótica. (4) Por último, se fusionan entre sí o con la fibra dañada para devolver el músculo a su estado original. (5) Al mismo tiempo, durante la activación/proliferación de mioblastos, una subpoblación permanece quiescente y repone el stock de MSC para futuras regeneraciones.
B. Representación esquemática de nuestro modelo in vitro y foto representativa de un cultivo de miotubos y MuRC tras 48 horas de diferenciación
ALTERNATIVAS AL SUERO DE TERNERA FETAL: PLASMA RICO EN PLAQUETAS (PRP)
Otra consideración importante se refiere a las condiciones de cultivo celular utilizadas para la expansión de las células musculares en el laboratorio.
Tradicionalmente, el suero fetal bovino (FBS) se ha utilizado ampliamente como fuente de nutrientes y factores de crecimiento para el cultivo celular.
Sin embargo, el uso de FBS tiene sus inconvenientes, como los riesgos de contaminación, la inmunogenicidad y las preocupaciones éticas relacionadas con su origen animal [8, 9, 10, 11].
Para superar estos problemas, se están buscando activamente alternativas al FBS. El plasma rico en plaquetas (PRP) es una de estas alternativas potenciales.
El PRP es un producto biológico derivado de la sangre, rico en factores de crecimiento contenidos en los gránulos alfa de las plaquetas.
Cuando se activa, el PRP libera estos factores de crecimiento, favoreciendo la regeneración de los tejidos.
Los distintos preparados de PRP incluyen PRP rica en leucocitos (LR-PRP) y PRP pobre en leucocitos (LP-PRP), así como lisado de plaquetas, que son derivados de la PRP [ ].12, 13, 14, 15, 16].
Estudios preliminares han demostrado que el PRP, ya sea de origen autólogo o alogénico, puede promover la proliferación de las células. in vitro.
Estos efectos beneficiosos se atribuyen a los factores de crecimiento contenidos en el PRP, como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [17, 18, 19, 20, 21].
Sin embargo, es necesario seguir investigando para evaluar plenamente su eficacia y seguridad, así como para resolver los problemas prácticos asociados a su uso generalizado en un entorno clínico.
COMBINACIÓN DE PRP CON ÁCIDO HIALURÓNICO
El ácido hialurónico (AH) es un componente esencial de la matriz extracelular que desempeña un papel crucial en diversos procesos biológicos, incluido el cultivo celular. in vitro.
Su uso ofrece varias ventajas significativas en los cultivos celulares, ya que proporciona un entorno propicio para el crecimiento, la diferenciación y la funcionalidad de las células [...22].
Una de las principales ventajas del uso de ácido hialurónico en cultivos celulares es que puede utilizarse de las siguientes maneras in vitro es su capacidad para estimular la proliferación celular.
Al proporcionar un sustrato tridimensional y una estructura de soporte, el ácido hialurónico crea un microentorno favorable al crecimiento celular, que puede aumentar la tasa de proliferación de las células en cultivo [?23].
Además, el ácido hialurónico ayuda a mantener la viabilidad celular proporcionando una hidratación adecuada y regulando el equilibrio osmótico en los cultivos celulares.
Actúa como depósito de agua, reteniendo la humedad necesaria para mantener las células sanas y funcionales durante todo el cultivo. in vitro.
Otra gran ventaja del ácido hialurónico es su capacidad para mejorar la adhesión celular.
Al proporcionar sitios de unión para receptores celulares específicos, favorece la adhesión de las células a la superficie de cultivo, lo que es esencial para su correcta supervivencia, proliferación y diferenciación [?24].
Por último, el ácido hialurónico puede desempeñar un papel en la modulación de la diferenciación celular al influir en las interacciones célula-matriz y en la señalización celular.
Los estudios han demostrado que su presencia en cultivos celulares puede promover la diferenciación celular en determinados tipos de células, como las células madre mesenquimales, los condrocitos y los adipocitos.
ESTUDIOS FUTUROS: EVALUACIÓN DEL EFECTO DE PRP Y PRP-HA
Así, en este estudio, planeamos investigar dos derivados de sangre humana (PRP humana alogénica no activada [PRP] o PRP humana alogénica no activada combinada con ácido hialurónico [PRP-HA]), utilizados como sustitutos de FBS para la expansión de células sanguíneas humanas. in vitro de mioblastos humanos primarios antes de la diferenciación miogénica.
Evaluaremos la tasa de proliferación in vitrola expresión de diferentes marcadores de superficie celular, su capacidad de diferenciación miogénica y el nivel de expresión del factor de transcripción Pax7 en las células de reserva musculares humanas generadas. in vitro.
Queremos comprobar si el PRP o el PRP-HA pueden sustituir eficazmente al FBS xenogénico en la expansión in vitro de mioblastos humanos, y si estas condiciones de cultivo no alteran su fenotipo inflamatorio.
Además, comprobaremos si los mioblastos humanos cultivados en medio de crecimiento suplementado con PRP o PRP-HA generan un mayor porcentaje de células de reserva Pax7High en comparación con los mioblastos tratados con FBS.
Nuestros resultados preliminares sugieren claramente que el PRP humano alogénico no activado o el PRP-HA son alternativas eficaces y adecuadas al FBS para la generación de células musculares humanas de reserva en un estado quiescente más profundo.
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