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ÁCIDO HIALURÓNICO :

DE LAS MOLÉCULAS ENDÓGENAS A LOS GELES INYECTABLES

                                   

Denis COUCHOUREL, PhD.  

Director Científico y Médico de los Laboratorios VIVACY

Ácido hialurónico endógeno En 1934, Karl Meyer y John Palmer descrito un nuevo polisacárido aislado inicialmente de del humor vítreo bovino. Esta sustancia contenía un ácido urónico y un aminoazúcar, por lo que se denominó ácido hialurónico (AH). En los años siguientes, la HA se aisló de muchas fuentes: el humor vítreo, el cordón umbilical humano y la cresta del gallo (Fuoss et al, 1948). En 1937, Kendall publicó un artículo que describía la presencia de AH en la cápsula de la bacteria Estreptococos de los grupos A y C (Kendall et al, 1937). Este trabajo revolucionaría el uso del ácido hialurónico muchos años después, ya que la fermentación bacteriana sigue siendo la fuente más fiable y segura de AH disponible para el desarrollo de aplicaciones médicas. Durante el mismo período, otras observaciones revelaron la existencia de una molécula capaz de aumentar drásticamente la permeabilidad del tejido conectivo al provocar la despolimerización del AH.  (Duran-Reynalds, 1929). Así, el estudio y el uso de hialuronidasas ha permitido comprender mejor la estructura primaria de la HA. Fue el científico húngaro Dr. Endre Balazs quien dio el impulso definitivo a la investigación de la HA. En particular, fue el primero en describir que la matriz extracelular de la membrana articular sinovial contenía suficiente AH viscoso para sustituir el líquido intraarticular (Balazs et al, 1943), allanando así el camino para todos los trabajos posteriores que condujeron a la primera aplicación médica sólida de las inyecciones de ácido hialurónico viscosuplementación de las articulaciones. Desde entonces, se han explorado otras vías en oftalmología, cirugía visceral y, por supuesto, en medicina estética. El ácido hialurónico es un polímero formado por disacáridos, cuya unidad base se repite n veces y está compuesta por un ácido glucónico y una N-acetilglucosamina (Figura 1)

Figura 1. Monómero de ácido hialurónico. El peso molecular de la HA es, por tanto, proporcional al número de disacáridos presentes. También es un polímero poli-aniónico, y por lo tanto altamente cargado eléctricamente.

Pertenece al grupo de los glicosaminoglicanos (GAG).  De ellos, el HA es el único GAG que no está asociado covalentemente a una proteína, el único que no se sintetiza a través del aparato de Golgi y el único que no está sulfatado. Su peso molecular puede alcanzar el 105 à 107 Daltons. In vivo, el AH desempeña un papel crucial en muchos procesos como: el mantenimiento de la viscoelasticidad de los fluidos biológicos (líquido sinovial, humor vítreo), el control de la hidratación de los tejidos, el transporte de agua, la organización de los proteoglicanos en las matrices extracelulares, la migración celular durante el desarrollo embrionario, el desarrollo de los procesos inflamatorios y la curación de heridas (Cowman et al, 2005). El HA es detectable en muchos tejidos humanos como: el humor vidrioso, cartílago,  líquido sinovial, la piel,  membranas mucosas (Almond A, 2007; Laurent UBG et al, 1991). Desde un punto de vista cuantitativo, en un hombre de 70 kg podríamos encontrar unos 15 gramos de AH, de los cuales un tercio se degradaría (y por tanto se resintetizaría) cada día. Se trata, por tanto, de una molécula muy frágil con una intensa y rápida rotación (Figura 2) .

Por lo tanto, la vida media de la HA endógena en las matrices extracelulares nunca supera unas pocas semanas. En la piel específicamente, la cantidad de AH medida es de 0,5 mg/g en la dermis y 100 mg/g en la epidermis (Reed y otros, 1988) con una vida media de 1,5 días (Tammi y otros, 1991). Es sintetizada por las "hialuronasas". que forman un grupo de 3 isozimas (HAS-1, HAS-2 y HAS-3). Funcionan de forma diferente, ya que son capaces de sintetizar moléculas de distinto peso molecular (Gupta, 2019). El AH se localiza en los compartimentos extracelulares en su mayoría, y obviamente tiene un papel crítico en la regulación de la homeostasis del agua y la hidratación de estos tejidos. Cabe señalar de paso que, aunque la epidermis es un tejido conectivo especializado formado por una abundante matriz extracelular y relativamente pocas células, es en la epidermis (donde los queratinocitos son proporcionalmente muy numerosos) donde la concentración de AH es más elevada. La piel es un órgano de protección contra estímulos como la luz, los rayos UV, los contaminantes y otros estreses oxidativos. En este contexto, el AH de la epidermis podría desempeñar un papel en la absorción de los radicales libres inducidos por estas agresiones externas, protegiendo así las estructuras adyacentes (colágeno y membranas celulares, en particular). 7 a 8g (50% de la cantidad total) se detectan específicamente en la piel (Hascell et al, 1997). Además de estas funciones intrínsecas (hidratación y protección antioxidante), es importante destacar que desde hace quince años se ha caracterizado un cierto número de receptores específicos de AH. Estas moléculas han sido denominadas en términos generales como hialadherinas. Esta es la clasificación.
La figura 3 nos muestra que las moléculas de AH son capaces de unirse a una quincena de receptores, ya sean transmembrana, membrana (es decir, móviles en la superficie celular), unidos a proteínas y glicosaminoglicanos de la matriz extracelular o disueltos en el líquido intersticial. Algunas, como la RHAMM, han sido muy bien caracterizadas e incluso clonadas gracias al trabajo de la profesora Eva Turley en 1992 (Turley E, 1992). La figura 4 resume las funciones que hemos podido dilucidar hasta la fecha.

Estas funciones también pueden variar según el tamaño (longitud) de la cadena de HA considerada. Una buena ilustración de este fenómeno se ha demostrado en el proceso de curación de heridas: Figura 5: Papel diferencial del AH en función de su tamaño en el proceso de cicatrización de la herida. Adaptado de Garg HG y Hales HA, 2004. Figura 5 nos muestra que el AH puede tener a veces una función inflamatoria caracterizada por la capacidad de promover el reclutamiento y la migración de ciertas células inmunitarias esenciales en las primeras fases de la cicatrización de las heridas, y a veces una función centrada en la organización de las matrices extracelulares y su supervivencia (vascularización, hidratación)

Por último, la HA también es una molécula muy conservada.  Durante la evolución de las especies, la estructura del ácido hialurónico no ha cambiado. Por ejemplo, se ha detectado en la subrama de los cefalocordados, que apareció hace más de 400 millones de años (Csoka et al, 2013). Debido a esta característica, las moléculas de AH extraídas de diferentes fuentes animales son muy bien toleradas por el cuerpo humano y no provocan reacciones inmunitarias específicas.

Sin embargo, esta afirmación no tiene en cuenta el grado de pureza de los AH utilizados en los preparados inyectables, así como las posibles modificaciones químicas que las moléculas de AH hayan podido sufrir durante la fabricación de estos preparados. Por lo tanto, se trata de parámetros clave que deben ser vigilados muy de cerca por los fabricantes de medicamentos o productos sanitarios que contengan HA, y que se analizarán en los párrafos siguientes.

Ácido hialurónico exógeno: producción.

1. Fuente animal.

Históricamente, la cresta del gallo es la primera fuente de AH que se ha explotado realmente a nivel industrial.  Este órgano contiene hasta 7,5 mg de AH por gramo de tejido. El AH se localiza principalmente en la zona fibrosa subcutánea de este órgano. Antes de la extracción, las crestas tuvieron que ser lavadas con agua y acetona, hasta que la solución se volvió clara, para evitar la degradación enzimática y la oxidación que sería deletérea para las moléculas de HA (Swann DA, 1968). A continuación, los tejidos se trituraron para pasar a la fase de extracción propiamente dicha. Se utilizaron diferentes disolventes, como agua destilada a alta temperatura, soluciones salinas o mezclas con disolventes orgánicos.

Se pudieron obtener rendimientos del orden de 93% cuando se llevó la temperatura del medio a unos 80 grados Celsius. Estas condiciones tenían la ventaja de inactivar las hialuronidasas tisulares, pero al mismo tiempo inducían una despolimerización parcial de la HA, ya que esta molécula es sensible a la temperatura. Por tanto, era necesario encontrar el compromiso adecuado para obtener tamaños de HA compatibles con las aplicaciones previstas.

Tras la extracción, la fase de purificación era obviamente muy importante para garantizar la máxima biocompatibilidad. En efecto, en el extracto estaban presentes proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, lípidos y mucopolisacáridos. Aunque los métodos utilizados se basaban esencialmente en una serie de precipitación (alcohol)/disolución (agua), trabajar a partir de una fuente animal requería además técnicas más complejas como la hidrólisis enzimática o el uso de disolventes orgánicos como el cloroformo.Akasaka et al, 1985; Laurent TC, 1970Estos protocolos largos, costosos y menos eficientes en términos de impurezas residuales llevaron a la industria a orientarse hacia la producción por biofermentación

2. Fuente bacteriana

En este sistema, las bacterias de los estreptococos del grupo A y C sintetizan la HA en forma de cápsula extracelular.  Los cultivos se realizan en un medio líquido, en reactores que permiten controlar con precisión las condiciones de crecimiento. Por lo tanto, la HA se segrega en el medio de cultivo en el que se sumergen las bacterias (Figura 6).

Este sistema de producción es un proceso sensible y un gran número de parámetros influyen en el tamaño de las moléculas de HA sintetizadas. Por ejemplo, el nivel de oxígeno disuelto, la disponibilidad de sustrato, el estrés mecánico debido a la agitación son factores que influyen en las características de la HA producida (Fallacara et al, 2018). Sin embargo, la síntesis bacteriana tiene muchas ventajas sobre las fuentes animales. En primer lugar, el rendimiento es mucho mayor (Armstrong et al, 1997).    En segundo lugar, la calidad del material producido es mucho mayor. Desde este punto de vista, es fundamental tener en cuenta dos parámetros: el peso molecular y la pureza. En efecto, el tamaño de las moléculas será un determinante importante para el fabricante de geles inyectables, ya que es uno de los parámetros que le permitirá desarrollar la reología de sus productos. En cuanto a la pureza, debe entenderse como un requisito previo, ya que estamos hablando de los residuos proteicos y nucleicos resultantes de la lisis de las bacterias necesarias para el proceso de fabricación. Se trata de moléculas altamente inmunogénicas que, si se encontraran en una concentración demasiado elevada en los geles inyectados, podrían ser fuente de intensas reacciones inflamatorias.

Las autoridades, en particular la Dirección Europea de Calidad del Medicamento (EDQM) han establecido, por supuesto, una serie de normas que imponen umbrales por encima de los cuales no se puede utilizar el AH para productos inyectables. En 2018, la producción bacteriana mundial de ácido hialurónico alcanzó las 500 toneladas, incluyendo 230 toneladas de HA de grado alimentario, 250 toneladas de HA de grado cosmético y solo 20 toneladas de grado inyectable. (https://cen.acs.org, 2018). Estas cifras ilustran la dificultad técnica de alcanzar niveles de pureza compatibles con las aplicaciones médicas. Actualmente, 16 empresas de todo el mundo están certificadas para suministrar a los fabricantes de productos inyectables. 

Fabricación y propiedades de los geles inyectables de AH utilizados en estética

Entre 2010 y 2017 el número de procedimientos con geles inyectables de HA aumentó en 97% (https://www.isaps.org/). Al mismo tiempo, los fabricantes han trabajado para ofrecer numerosas innovaciones tecnológicas (Fagien et al, 2019).

En efecto, a pesar de que los productos comparten los mismos puntos de inyección, existen diferencias fisicoquímicas y reológicas que los distinguen, a veces de forma significativa. La reología, es decir, el estudio del comportamiento de un material cuando se le somete a una tensión mecánica, es una consecuencia directa de las decisiones tomadas por los fabricantes de geles inyectables en sus procesos de fabricación. Más concretamente, la concentración de AH, su peso molecular y la intensidad de la reticulación (así como la tecnología utilizada) son datos que van a incidir directamente en el comportamiento mecánico del gel. En general, no es fácil abordar estos temas desde una perspectiva reológica.  De hecho, esta ciencia es compleja e implica conceptos matemáticos que pueden no proporcionar la información esencial a los profesionales interesados en el tema.

Por lo tanto, primero examinaremos las necesidades y luego sacaremos una serie de conclusiones sobre las propiedades necesarias para determinar si un producto inyectable es adecuado o no.

Por lo tanto, primero examinaremos las necesidades y luego sacaremos una serie de conclusiones sobre las propiedades necesarias para determinar si un producto inyectable es adecuado o no. En general, actualmente se realizan 3 tipos de inyecciones en las consultas médicas, independientemente de la indicación considerada: inyecciones muy superficiales (dermis media y superficial) con el objetivo de mejorar la calidad y el aspecto de la piel, dinyecciones medias (dermis profunda e hipodermis superficial) con el objetivo de corregir las arrugas y las líneas de expresión, y des inyecciones profundas (hipodermis o grasa profunda) para crear o restaurar volúmenes. Por lo tanto, es importante discutir algunos aspectos biomecánicos de estos diferentes tejidos objetivo para entender los parámetros reológicos. 1. La dermis La dermis es un tejido conjuntivo denso, irregular y especializado, con una tupida red de fibras de colágeno y elastina. (Guía de Histología de la Universidad de Leeds). El colágeno por sí solo representa 75% de la dermis (peso seco). Se han identificado 28 tipos de colágenospero, por supuesto, es colágeno tipo I que es el mayoritario en la piel, también están presentes los tipos III, IV, VII, XIII y XIV (Nemoto T et al, 2012). Desde el punto de vista mecánicoTambién es interesante señalar que el tipo XIV pertenece a un subgrupo de la superfamilia del colágeno: los colágenos FACIT (Colágeno Asociado a Fibrillas con Triple Hélice Interrumpida) (Shaw LM et al, 1991). Su naturaleza química es diferente de la de los colágenos fibrilares. Por otra parte, al asociarse con las moléculas de tipo I, refuerzan la resistencia mecánica de las matrices en las que están presentes (Nemoto T et al, 2012). En concreto, esta resistencia puede medirse evaluando el módulo de Young. Este cálculo describe la capacidad de un material para resistir la deformación cuando se le aplica una fuerza (McKee et al, 2011). Sin embargo, en el caso de la dermis, se observa que la resistencia aumenta bruscamente con el aumento de la tensión. Este comportamiento excepcional es típico del contenido rico en colágeno (Licup AJ et al, 2015). También hay que tener en cuenta que más fibras de colágeno están organizadas y alineadas, mayor es el valor de tensión máxima a partir del cual las fibras se dañan irremediablemente (Aziz J et al, 2016). Fibras elásticas son un grupo de proteínas de la matriz que son sintetizadas por el fibroblasto a través de un complejo proceso llamado elastogénesis basado en un precursor, la tropoelastina. Del mismo modo que el colágeno es esencial para dar a la piel su resistencia a la tracción, elastina le da la propiedad de expandirse y luego volver a la normalidad sin sufrir daños mecánicos irreversibles (Rauscher S et al, 2012). Este tipo de fibra es abundante en la dermis, y su importancia queda patente al estudiar, por ejemplo, los síntomas de los pacientes con cutis laxa (una enfermedad rara que afecta al sistema de ensamblaje de las fibras elásticas).  Además de los graves daños en los sistemas respiratorio, digestivo y vascular, la piel de estos pacientes aparece flácida, inestable y prematuramente envejecida (Andiran N et al, 2002). Estos datos ilustran, pues, el papel predominante que desempeña la red de fibras de elastina en las propiedades biomecánicas de la piel. Los colágenos y la elastina son, por tanto, los principales elementos de la matriz extracelular de la dermis. Por lo tanto, puede describirse como extremadamente denso (como se ilustra en Figura 7). Por lo tanto, un gel de ácido hialurónico inyectable dedicado a este plano de inyección tendrá que estar necesariamente adaptado reológicamente a este entorno particular. Más adelante veremos cómo.
2. La hipodermis El tejido adiposo subcutáneo es un tejido conectivo situado entre la dermis y las aponeurosis musculares. Histológicamente, Se trata de una asociación suelta de adipocitos llena de una gota de lípidos (de 90 a 99% de triglicéridos) y de 2 a 3% de proteínas. El diámetro de estas células es grande: de 30 a 70µm (Avram AS et al, 2005). Se organizan en lóbulos grasos separados entre sí por tabiques de tejido conectivo. En comparación con la dermis, muy pocos autores se han centrado en biomecánica del tejido adiposo, pero varios estudios han demostrado que el módulo de Young del tejido adiposo puede variar entre 0,5 y 25 KPa (Kilo Pascal) (Gefen A et al, 2007). Es interesante comparar estos valores con los 21 a 39 -MPa (Mega Pascal) medidos en la dermis (McKee et al, 2011) ya que son mucho más bajos. Estos resultados implican, por tanto, un comportamiento mecánico extremadamente diferente de la dermis, que debe explicarse necesariamente por diferencias estructurales fundamentales en la matriz extracelular. Cuando se observa el tejido adiposo mediante microscopía electrónica de barrido, estas diferencias se hacen aún más evidentes. La figura 8 está tomada de un artículo (Panetttiere P et al, 2011) cuyos autores trataron de destacar las características ultraestructurales de la almohadilla de grasa trocantérica. De hecho, es una fuente potencial de grasa interesante para los injertos autólogos, incluso a nivel facial. (Raskin BI, 2009). Por lo tanto, la red fibrilar que sostiene a los adipocitos parece mucho menos densa y extensa que la que puede encontrarse en la dermis. Por lo tanto, el comportamiento mecánico de la hipodermis no sólo será muy diferente del de la dermis, sino que su estructura también requerirá la adaptación de los geles de ácido hialurónico que se inyecten en ella.

3. Adaptación de los inyectables al plano de inyección

Por lo tanto, acabamos de describir dos entornos característicos en los que los productos tendrán efecto a lo largo de su vida "activa". Por tanto, hay que recordar que estos geles son materiales "viscoelásticos".  En otras palabras, todos ellos tienen el llamado componente viscoso (η) que les permite extenderse más o menos, y un componente elástico que les permite resistir una fuerza exógena y, por tanto, volver más fácilmente a su forma original (Heitmiller K et al, 2021).  Estas 2 propiedades se ilustran con el Figura 10.

Transpongamos ahora estos 2 simples parámetros a los datos descriptivos de la dermis y la hipodermis desarrollados anteriormente:

La dermis: Un gel para ser inyectado en este plano debe tener una baja viscosidad (η) debido a la alta densidad de la matriz extracelular. De este modo, el gel respetará las estructuras histológicas y no será demasiado traumático. Tendrá una fuerte tendencia a extenderse. Por otro lado, la dermis es, por definición, superficial. Por lo tanto, habrá poca presión inducida por los tejidos entre el gel y la superficie de la piel. Por lo tanto, el producto no debe ser demasiado elástico, ya que, de lo contrario, provocará una sobrecorrección, lo cual es perjudicial para los resultados estéticos esperados.

Hipodermis: el razonamiento es inverso. El gel se inyecta en un tejido con una matriz extracelular mucho menos densa. Su viscosidad (η) debe ser entonces alta para que pueda permanecer lo más posible en la zona donde el profesional desea colocarla. El tejido adiposo también es más profundo que la dermis. Por lo tanto, el gel tendrá que soportar una compresión mucho mayor y su elasticidad deberá ajustarse en consecuencia. Si no es así, el producto tenderá a aplastarse bajo esta fuerza y no podrá inducir la creación de volumen deseada en la superficie.

Es importante considerar un tercer parámetro: la cohesión.  Esto puede definirse por la capacidad del material de disociarse o no. En otras palabras, dependiendo de la tecnología utilizada, las moléculas de AH tendrán más o menos afinidad por sus vecinos (Sundaram H. et al, 2015). Si la cohesividad es baja, el producto tenderá a dividirse en una miríada de microbolos separados entre sí; por el contrario, si la cohesividad es alta, el producto parecerá colocarse en el tejido objetivo como una sola unidad, de forma homogénea. Por lo tanto, la cohesividad es un factor importante a tener en cuenta en combinación con la viscosidad para respetar y preservar las estructuras íntimas de la matriz extracelular (Tran C et al, 2014). La biointegración óptima debería ser también, lógicamente, una noción clave para la seguridad del producto.

Por supuesto, existen otras limitaciones inherentes a los movimientos provocados por las contracciones musculares, lo que hace que la definición de la reología ideal para un plano de inyección sea más compleja que la combinación de elasticidad, viscosidad y cohesividad (Gavard-Molliard S et al, 2018).  No obstante, el razonamiento desarrollado anteriormente constituye la base de una gama coherente y lógica de productos inyectables.

4. ¿Cómo se puede variar la reología de un gel?

Se pueden manipular tres parámetros principales para conseguir la reología deseada.

Reticulación : El objetivo inicial de esta etapa de fabricación del gel es aumentar su vida útil in vivo. De hecho, hemos visto anteriormente que el ácido hialurónico endógeno es una molécula muy frágil con una vida media baja. Para aumentar su vida útil, la reacción de reticulación permite acercar las cadenas de HA. Para ello, es necesario utilizar una molécula reactiva, capaz de crear enlaces covalentes entre 2 moléculas de HA. La inmensa mayoría de los productos disponibles en el mercado utilizan éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE) para esta reacción.

También es posible utilizar otras moléculas, pero éstas deben tener una alta actividad química para poder reaccionar con el AH. Este es el caso, por ejemplo, del polietilenglicol (PEG), que debe funcionalizarse para convertirse en PEGDE (éter diglicidílico de polietilenglicol) antes de ser utilizado (Zerbinati et al, 2021). Cuando se realiza la reticulación, el espacio entre las moléculas de AH se vuelve tan pequeño que dificulta el acceso de las hialuronidasas endógenas. Pero estas modificaciones tridimensionales también tienen un impacto muy fuerte en la reología. En efecto, el tamaño de malla de la red creada disminuye a medida que aumenta la tasa de reticulación. La elasticidad y la viscosidad aumentan entonces fuertemente.

Concentración : Cuando el AH está en solución acuosa a pH fisiológico, los grupos carboxilo se disocian y el polímero lleva un número muy grande de cargas negativas. En consecuencia, es capaz de atraer la mayoría de los cationes osmóticamente activos (sodio, potasio, calcio...), pero también las moléculas de agua.

Así, la HA puede unirse mediante enlaces débiles más de 1000 veces el peso del agua de la cadena de HA considerada (Khabarov et al, 2015). Debido a esta propiedad, las cadenas de AH ocupan un volumen extremadamente grande y son capaces de formar geles incluso a bajas concentraciones. Si esta concentración aumenta, la viscosidad de la solución se incrementa, especialmente debido a la formación de una red tridimensional basada en la formación de enlaces electrostáticos débiles. Por lo tanto, es una forma sencilla de influir en la reología de los geles. Por lo tanto, también es un factor que aumentará la higroscopicidad del gel considerado.

El peso molecular de las moléculas de HA : De nuevo, este parámetro influirá en la densidad de la red de formación de gel. Cuanto mayor sea el tamaño de la cadena de HA, mayor será el plegado, lo que también provoca un aumento drástico de la viscosidad.

Por tanto, los fabricantes de geles deben dominar los efectos diferenciales de estos tres parámetros.  Por ejemplo, es posible que una restricción particular imponga disminuir o aumentar uno de estos factores (la concentración, por ejemplo, para modificar la higroscopia), pero entonces será posible mantener en gran medida el comportamiento reológico inicial jugando con los otros dos parámetros. Por ello, no es posible basar el comportamiento de un gel únicamente en el valor de la concentración y concluir, por ejemplo, que es muy voluminizador y adecuado para el tejido graso.

Conclusión:

El ácido hialurónico es, por tanto, una molécula endógena esencial para las matrices extracelulares y con notables propiedades que el organismo aprovecha en compartimentos muy específicos (humor vítreo, cavidad articular, etc.).

También es una molécula biológicamente activa que participa en muchos procesos de señalización. Está muy conservada en todas las especies, lo que nos ha permitido desarrollar aplicaciones humanas utilizando sistemas de producción bacteriana, que son por tanto fiables y reproducibles.

Entre estos usos, la medicina estética está en primera línea, ya que es donde los retos para los fabricantes son mayores.  En efecto, los tejidos inyectados son histológicamente muy diversos, el nivel de complejidad anatómica y fisiológica de la cara es importante y la tolerancia a los efectos secundarios es muy baja.

Así, el comportamiento reológico de los geles tuvo que ser desarrollado y perfeccionado por los fabricantes para buscar constantemente la mejor biointegración posible, al tiempo que se buscaba el mejor rendimiento clínico posible.

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