Denis COUCHOUREL, PhD
Scientific and Medical Director of VIVACY Laboratories
En 1934, Karl Meyer et John Palmer décrivirent un nouveau polysaccaride initialement isolé à partir d’humeur vitrée bovine. Cette substance contenait un acide uronique et un sucre aminé, elle a donc été baptisé acide hyaluronique (AH).
Durant les années qui suivirent, l’AH fut isolé à partir de nombreuses sources : l’humeur vitrée, le cordon ombilical humain ainsi que la crête de coq (Fuoss et al, 1948).
En 1937, Kendall publia un article qui décrivait la présence d’AH dans la capsule des bactéries Streptococci de groupes A et C (Kendall et al, 1937).
Ce travail allait révolutionner l’utilisation de l’acide hyaluronique bien des années plus tard puisque la fermentation bactérienne constitue encore actuellement la source d’AH la plus fiable et la plus sûre dont nous disposons pour le développement des applications médicales.
Durant la même période, d’autres observation ont permis de mettre en évidence l’existence d’une molécule capable de d’augmenter drastiquement la perméabilité des tissus conjonctifs en provoquant la dépolymérisation de l’AH. (Duran-Reynalds, 1929).
Ainsi, l’étude et l’utilisation des hyaluronidases a permis de mieux comprendre la structure primaire de l’AH. C’est ensuite le Dr Endre Balazs scientifique hongrois, qui a définitivement impulsé la recherche applicative sur l’AH.
En particulier, il a été le premier à décrire que le fait que la matrice extracellulaire de la membrane synoviale articulaire contenait assez d’AH visqueux pour remplacer le liquide intra-articulaire (Balazs et al, 1943) a ainsi ouvert la voie à tous les travaux subséquents qui ont mené à la première application médicale robuste des injections d’acide hyaluronique : la viscosupplémentation articulaire.
Depuis, d’autres voies ont été exploitées dans l’ophtalmologie, la chirurgie viscérale et bien entendu dans la médecine esthétique.
Ces applications tirent essentiellement partie des propriétés rhéologiques particulières qui peuvent être obtenues à partir de gels d’AH.
L’acide hyaluronique est un polymère composé de disaccharides, dont l’unité de base répétée n fois, est composée d’un acide gluconique et d’un N-acétyl glucosamine (Figure 1).
Il appartient au groupe des glycosaminoglycanes (GAG). Parmi ceux-ci, l’AH est le seul GAG non associé de manière covalente à une protéine, le seul non synthétisé via l’appareil de Golgi, et le seul qui n’est pas sulfaté. Sa masse moléculaire peut atteindre 105 à 107 Daltons.
In vivo, l’AH joue un rôle crucial dans de nombreux processus tels que : le maintien de la viscoélasticité des liquides biologiques (liquide synovial, humeur vitrée), le contrôle de l’hydratation des tissus, le transport de l’eau, l’organisation des protéoglycans dans les matrices extra-cellulaires, les migrations cellulaires lors du développement embryonnaire, le développement des processus inflammatoires et la cicatrisation (Cowman et al, 2005).
L’AH est détectable dans de nombreux tissus humains tels que: l’humeur vitrée, le cartilage, le liquide synovial, la peau, les muqueuses (Almond A, 2007 ; Laurent UBG et al, 1991).
D’un point de vue quantitatif, chez un homme de 70kg nous pourrions retrouver environ 15 grammes d’AH dont le tiers serait dégradé (et donc resynthétisé) chaque jour.
C’est donc une molécule très fragile avec un turn-over intense et rapide (Figure 2).
Ainsi, la demi-vie de l’AH endogène dans les matrices extra-cellulaires n’excède jamais quelques semaines. Dans la peau spécifiquement, la quantité d’AH mesurée s’établit à 0,5 mg/g dans le derme et 100 mg/g dans l’épiderme (Reed et al, 1988) avec une demi-vie de 1,5 jour (Tammi et al, 1991).
Il est synthétisé par les « hyaluronan synthases » qui forment un groupe de 3 isozymes (HAS-1, HAS-2 et HAS-3). Elles fonctionnement différemment puisqu’elles sont capables de synthétiser des molécules de différents poids moléculaires.(Gupta, 2019).
L’AH est localisé dans les compartiments extracellulaires majoritairement, et a bien évidemment un rôle critique dans la régulation de l’homéostasie hydrique et l’hydratation de ces tissus.
Notons au passage que bien que l’épiderme soit un tissu conjonctif spécialisé constitué d’une matrice extracellulaire abondante et de relativement peu de cellules, c’est bien dans l’épiderme (où cette fois les kératinocytes sont proportionnellement très nombreux) que la concentration d’AH est la plus élevée.
Or, la peau est un organe de protection contre des stimuli tels que la lumière, les UV, les polluants et autres stress oxydatifs.
Dans ce contexte, l’AH de l’épiderme pourrait jouer un rôle d’absorbeur des radicaux libres induits par ces agressions externes protégeant de ce fait les structures qui lui sont adjacentes (collagène et membranes cellulaires notamment).
7 à 8g (50 % de la quantité totale) sont d’ailleurs spécifiquement détectés dans la peau (Hascell et al, 1997).
En marge de ces fonctions intrinsèques (hydratation et protection anti-oxydative), il est important de souligner qu’un certain nombre de récepteurs spécifiques à l’AH ont été caractérisés depuis une quinzaine d’années.
Ces molécules ont été globalement désignées sous le terme de hyaladherines.
En voici la classification:
La Figure 3 nous montre que les molécules d’AH sont capables de se fixer à une quinzaine de récepteurs, qu’ils soient transmembranaires, membranaires (c’est-à-dire mobiles à la surface de la cellule), liés aux protéines et GAG de la matrice extracellulaire ou encore dissous dans le liquide interstitiel. Certains comme RHAMM ont été très bien caractérisés et même clonés grâce aux travaux du Pr Eva Turley en 1992 (Turley E, 1992).
La Figure 4 résume les fonctions que nous avons pu élucider à date. Ces fonctions peuvent aussi varier en fonction de la taille (de la longueur) de la chaine d’AH considérée. Une bonne illustration de ce phénomène a été démontré dans le processus de cicatrisation.
La Figure 5 nous montre que l’AH peut avoir tantôt un rôle inflammatoire caractérisé par une capacité à favoriser le recrutement et la migration de certaines cellules immunitaires indispensables aux phases précoces de la cicatrisation, tantôt une fonction tournée au contraire vers l’organisation des matrices extracellulaires et leur survie (vascularisation, hydratation).
Enfin, l’AH est aussi une molécule très conservée. Durant l’évolution des espèces, la structure de l’acide hyaluronique n’a pas changé. Il a par exemple été détecté dans le sous-embranchement des céphalochordés, qui sont apparus il y a plus de 400 millions d’années (Csoka et al, 2013).
À cause de cette caractéristique, les molécules d’AH extraites de différentes sources animales sont très bien tolérées par l’organisme humain et ne provoquent pas de réactions immunitaires spécifiques particulières.
However, this statement does not take into account the degree of purity of the HA used in the injectable preparations as well as any chemical modifications that the HA molecules may have undergone during the manufacture of these preparations.
These are therefore key parameters that need to be very closely monitored by manufacturers of HA-containing drugs or medical devices, and will be discussed in the following paragraphs.
Dans ce système, l’AH est synthétisé sous forme de capsule extracellulaire par les bactéries Streptococci des groupes A et C. Les cultures sont réalisées en milieu liquide, au sein de réacteurs permettant de contrôler finement les conditions de croissance. L’AH est donc sécrété dans le milieu de culture dans lequel baignent les bactéries (Figure 6).
Ce système de production est un processus sensible et un grand nombre de paramètres influent sur la taille des molécules d’AH synthétisées. Par exemple, le taux d’oxygène dissout, la disponibilité du substrat, le stress mécanique lié à l’agitation sont autant de facteurs influençant les caractéristiques de l’AH produit (Fallacara et al, 2018).
Néanmoins, la synthèse bactérienne présente de nombreux avantages par rapport aux sources animales. En premier lieu, le rendement est beaucoup plus important (Armstrong et al, 1997).
Secondly, the quality of the material produced is far superior.
From this point of view, 2 parameters are fundamental to consider: the molecular weight and the purity.
En effet, la taille des molécules sera un déterminant important pour le fabricant de gels injectables puisque c’est un des paramètres qui lui permettront de mettre au point la rhéologie de ses produits. La pureté quant à elle doit s’entendre comme un prérequis puisque nous parlons ici des résidus protéiques et nucléiques issus de la lyse des bactéries nécessaire au processus de fabrication.
Ce sont des molécules hautement immunogènes qui, si elles devaient se retrouver à trop forte concentration dans les gels injectés, pourraient être sources de réactions inflammatoires intenses.
Les autorités, et notamment l’EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare) ont bien entendu édicté un certain nombre de normes qui imposent des seuils au-delà desquels l’AH ne peut pas être utilisé pour des produits injectables.
En 2018, la production bactérienne mondiale d’acide hyaluronique atteignait 500 tonnes, incluant 230 tonnes d’AH de qualité alimentaire, 250 tonnes d’AH de qualité cosmétique et seulement 20 tonnes de qualité injectable. (https://cen.acs.org, 2018).
These figures illustrate the technical difficulty of obtaining purity levels compatible with medical applications.
16 companies worldwide are currently certified to supply injectable manufacturers.
The dermis
Le derme est un tissu conjonctif dense, irrégulier et spécialisé comportant un réseau serré de collagène et de fibres d’élastine (Leeds University Histology Guide).
Le collagène représente à lui seul 75 % du derme (poids sec). 28 types of collagens have been identifiedbut it is of course type I collagen qui est majoritaire dans la peau, les types III, IV, VII, XIII et XIV sont aussi présents (Nemoto T et al, 2012).
From a mechanical point of view, il est intéressant aussi de noter que le type XIV appartient à un sous-groupe de la superfamille des collagènes : les collagènes FACIT (Fibril Associated Collagen with Interrupted Triple helixes) (Shaw LM et al, 1991).
Their chemical nature est différente de celle des collagènes fibrillaires. En revanche, en s’associant avec les molécules de type I, ils renforcent la résistance mécanique des matrices dans lesquelles ils sont présents (Nemoto T et al, 2012).
Plus précisément, il est possible de mesurer cette résistance en évaluant le module de Young. Ce calcul décrit la capacité d’un matériau à résister à une déformation lorsqu’une force lui est appliquée (McKee et al, 2011). Or, dans le cas du derme, on note que la résistance augmente fortement à mesure que le stress s’intensifie.
Ce comportement exceptionnel est typique d’un contenu riche en collagène (Licup AJ et al, 2015). Notons aussi que plus collagen fibers sont organisées et alignées, plus la valeur de tension maximale au-delà de laquelle les fibres sont irrémédiablement endommagées est grande (Aziz J et al, 2016).
Elastic fibers sont un groupe de protéines matricielles qui sont synthétisées par le fibroblaste par un processus complexe appelé élastogénèse basée sur un précurseur, la tropoélastine. De la même façon que le collagène est indispensable pour donner à la peau sa résistance à la traction, elastin gives it the property to expand and then return to normal without suffering irreversible mechanical damage (Rauscher S et al, 2012).
Ce type de fibre est abondant dans le derme, et son importance est illustrée lorsque l’on étudie par exemple les symptômes des patients atteints de cutis laxa (maladie rare qui touche le système d’assemblage des fibres élastiques). Outre des atteintes graves au niveau des systèmes respiratoires, digestifs et vasculaires, la peau de ces patients apparait molle, sans aucune tenue et présente prématurément un aspect âgé (Andiran N et al, 2002).
Ces données illustrent donc le rôle prépondérant tenu par le réseau de fibres d’élastine dans les propriétés biomécaniques de la peau. Collagènes et élastine représentent donc les éléments principaux de la matrice extracellulaire du derme. Elle peut par conséquent être qualifiée d’extrêmement dense (comme illustré dans la Figure 7).
Ainsi, un gel d’acide hyaluronique injectable dédié à ce plan d’injection devra nécessairement être adapté rhéologiquement à cet environnement particulier. Nous verrons par la suite de quelle manière.
L’hypoderme
Le tissu adipeux sous-cutané est un tissu connectif se situant entre le derme et les aponévroses musculaires. Histologiquement, c’est une association lâche d’adipocytes remplis d’une gouttelette lipidique (90 à 99 % de triglycérides) et de 2 à 3 % de protéines. Le diamètre de ces cellules est important : 30 à 70 μm (Avram AS et al, 2005). Elles sont organisées en lobules graisseux séparés les uns des autres par des septa de tissu conjonctif. Comparé au derme, très peu d’auteurs se sont consacrés à la biomécanique du tissu adipeux, mais un certain nombre de travaux ont montré que le module de Young tissus graisseux pouvait varierde 0,5 à 25 KPa (Kilo Pascal) (Gefen A et al, 2007).
Il est intéressant de comparer ces valeurs aux 21 à 39 -MPa (Mega Pascal) mesurés sur le derme (McKee et al, 2011) puisqu’elles sont très nettement inférieures. Ces résultats sous-entendent donc un comportement mécanique extrêmement différent du derme, qui doit nécessairement être expliquée par des différences structurelles fondamentales au niveau de la matrice extracellulaire. Lorsque le tissu adipeux est observé en microscopie électronique à balayage, ces différences apparaissent de manière encore plus évidente.
La Figure 8 est tirée d’un article (Panetttiere P et al, 2011) dont les auteurs ont cherché à mettre en évidence les caractéristiques ultra-structurelles du coussin graisseux trochantérique. En effet, il s’agit d’une source potentielle de graisse intéressante pour les greffes autologue, y compris au niveau facial (Raskin BI, 2009). Le réseau fibrillaire soutenant les adipocytes apparaît donc beaucoup moins dense et fourni que celui qui peut être retrouvé dans le derme.
The mechanical behavior of the hypodermis will therefore not only be very different from that of the dermis, but its structure will also impose an adaptation of the hyaluronic acid gels that will be injected there.
Comment peut-on faire varier la rhéologie d’un gel ?
Three main parameters can be manipulated to achieve the desired rheology.
La réticulation
The initial purpose of this gel manufacturing step is to increase its in vivo life span. Indeed, we have seen above that endogenous hyaluronic acid is a very fragile molecule with a low half-life. To increase its life span, the cross-linking reaction allows the HA chains to be brought closer together. To do this, it is necessary to use a reactive molecule, capable of creating covalent bonds between 2 HA molecules. The overwhelming majority of products available on the market use 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) for this reaction.
Il est aussi possible d’utiliser d’autres molécules, mais celles-ci doivent nécessairement présenter une forte activité chimique pour pouvoir réagir avec l’AH. C’est par exemple le cas du polyethylene glycol (PEG) qui dont être fonctionnalisé pour devenir du PEGDE (polyethylene glycol diglycidyl ether) avant d’être utilisé (Zerbinati et al, 2021). Lorsque la réticulation est effectuée, l’espace entre les molécules d’AH devient faible au point de gêner l’accès des hyaluronidases endogènes. Mais ces modifications tridimensionnelles ont aussi un très fort impact sur la rhéologie. En effet, la taille des mailles du réseau créé diminue au fur et à mesure que le taux de réticulation augmente. L’élasticité et la viscosité sont alors fortement augmentées.
La concentration
When HA is in aqueous solution at physiological pH, the carboxyl groups are dissociated and the polymer carries a very large number of negative charges. Consequently, it is able to attract most osmotically active cations (Sodium, potassium, calcium...), but also water molecules.
Thus, HA can bind via weak bonds more than 1000 times the weight of water in the considered HA chain (Khabarov et al, 2015). Because of this property, HA chains occupy an extremely large volume and are able to form gels even at low concentrations. If this concentration increases, then the viscosity of the solution increases, especially due to the formation of a three-dimensional network based on the formation of weak electrostatic bonds. It is therefore a simple way to act on the rheology of gels. It is therefore also a factor that will increase the hygroscopicity of the gel considered.
Le poids moléculaire des molécules d’AH
Again, this parameter will influence the density of the network forming the gel. The larger the size of the HA chains, the more important their folding is, causing a drastic increase of the viscosity.
Les fabricants de gels doivent donc maîtriser finement les effets différentiels de ces trois paramètres. Par exemple, il est possible qu’une contrainte particulière impose de baisser ou d’augmenter l’un de ces facteurs (la concentration par exemple, de façon modifier l’hygroscopie), mais il sera alors largement possible de maintenir le comportement rhéologique initial en jouant sur les deux autres paramètres. C’est la raison pour laquelle il n’est pas possible de se baser sur la seule valeur de concentration pour prévoir le comportement d’un gel et pour conclure par exemple que celui-ci est très volumateur et est adapté au tissu graisseux.
CONCLUSION
Hyaluronic acid is thus an endogenous molecule essential to extracellular matrices and with remarkable properties which are exploited by the organism in very precise compartments (vitreous humor, articular cavity?).
C’est aussi une molécule biologiquement active impliquée dans de nombreux processus de « signaling ». Elle est extrêmement conservée à travers les espèces, ce qui nous a permis de développer des applications humaines à partir de systèmes de production bactériens, donc fiables et reproductibles.
Parmi ces utilisations, la médecine esthétique est en pointe, puisque c’est dans cette spécialité que les challenges pour les fabricants sont les plus demandants. En effet, les tissus injectés sont histologiquement très divers, le niveau de complexité anatomique et physiologique de la face est important, et la tolérance aux effets secondaires très réduite.
Thus, the rheological behavior of the gels had to be further developed and refined by the manufacturers to constantly strive for the best possible bio-integration while aiming at the best possible clinical performance.
