ÉVALUATION DU PLASMA RICHE EN PLAQUETTES (PRP) COMME ALTERNATIVE AU SÉRUM DE VEAU FŒTAL (FBS) DANS L’EXPANSION DES MYOBLASTES HUMAINS : UN PROTOCOLE IN VITRO.
Axel TOLLANCE1,3, Diego MICHEL1, Alexandre PROLA2, Axelle BOUCHE1,2, Antoine TURZI3, Didier HANNOUCHE1,2, Thomas LAUMONIER1,2 and Sarah BERNDT3
- 1 Department of Orthopedic Surgery, Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine, Geneva, Switzerland.
- 2 Department of Cell Physiology and Metabolism, Faculty of Medicine, Geneva, Switzerland.
- 3 Regen Lab SA, 1052 Le Mont-sur-Lausanne, Switzerland.
Mots-clés : plasma riche en plaquettes, cellules souches musculaires, expansion cellulaire, régénération musculaire.
INTRODUCTION
Les maladies musculaires, qu’elles soient congénitales, acquises ou dégénératives, constituent un défi majeur pour la santé publique, affectant la qualité de vie des patients et entraînant souvent une morbidité significative.
La régénération musculaire est un processus complexe qui implique la participation de diverses populations cellulaires, notamment les cellules souches musculaires (CSM), qui jouent un rôle central dans la restauration de l’intégrité et de la fonction musculaires après des lésions [1, 2].
Cependant, dans des conditions pathologiques telles que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), les capacités de régénération musculaire sont compromises, mettant en évidence la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter ces maladies musculaires débilitantes.
LES CELLULES SOUCHES MUSCULAIRES ET LEUR RÔLE DANS LA RÉGÉNÉRATION MUSCULAIRE
Les CSM résident dans un état quiescent entre la fibre musculaire et la lame basale, prêtes à être activées en cas de besoin, comme lors d’une lésion musculaire.
Ces cellules jouent un rôle crucial dans la régénération et la croissance musculaire postnatale, assurant ainsi l’intégrité et la fonctionnalité du tissu musculaire tout au long de la vie. Lorsque des dommages surviennent dans le muscle, que ce soit suite à un traumatisme ou à une maladie, les CSM sont activées pour répondre à la demande de réparation.
Ce processus implique une activation des CSM suivie d’une prolifération des cellules progénitrices, appelées myoblastes, qui peuvent ensuite se différencier en cellules musculaires matures et intégrer le tissu musculaire pour restaurer sa fonctionnalité [3].
Dans des conditions pathologiques telles que la DMD, ces processus de régénération sont compromis en raison de dysfonctionnements des CSM.
Dans le cas de la DMD, une mutation dans le gène de la dystrophine entraîne une dégénérescence musculaire progressive, conduisant à une diminution de la fonction musculaire et à une incapacité à régénérer efficacement les tissus musculaires endommagés.
Les CSM dans les muscles affectés par la DMD montrent une altération de leur capacité proliférative et une diminution de leur potentiel de différenciation, ce qui contribue à la progression de la maladie et à la détérioration musculaire.
THÉRAPIES BASÉESSUR LES CELLULES SOUCHES MUSCULAIRES
Les thérapies basées sur les CSM ont suscité un intérêt considérable en tant que stratégies potentielles pour la réparation musculaire. Les lésions musculaires traumatiques, telles que les ruptures ou les déchirures musculaires, pourraient bénéficier de thérapies basées sur les cellules souches musculaires pour accélérer le processus de guérison et restaurer la fonction musculaire normale [4, 5]. En injectant des cellules souches musculaires directement dans la zone lésée, il est possible de favoriser la régénération tissulaire et de réduire la formation de cicatrices, ce qui pourrait améliorer les résultats cliniques pour les patients souffrant de telles blessures.
Cependant, malgré leur potentiel prometteur, plusieurs défis restent à relever avant que les thérapies basées sur les cellules souches musculaires ne deviennent courantes en clinique.
Ces défis comprennent la nécessité de développer des méthodes efficaces pour isoler et cultiver les cellules souches musculaires en quantités suffisantes, ainsi que la compréhension des mécanismes sous-jacents de leur différenciation et de leur intégration dans les tissus musculaires endommagés.
Une préoccupation majeure réside dans la sélection et l’expansion des cellules appropriées en quantités suffisantes pour une application thérapeutique efficace [6].
À cet égard, l’identification de nouvelles sources de cellules, telles que les cellules réserve musculaire humaine (CRMH), représente un progrès significatif.
Ces cellules partagent de nombreuses caractéristiques des CSM quiescentes et présentent un potentiel prometteur pour la thérapie cellulaire musculaire
EXPLICATION DU MODÈLE IN VITRO UTILISÉ
Pour mieux comprendre le comportement des cellules musculaires et évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies, nous avons utilisé un modèle in vitro basé sur des cellules souches humaines primaires.
Nous avons d’abord extrait les cellules mononuclées d’une biopsie musculaire, avons spécifiquement sélectionnées les cellules souches musculaire par cytométrie de flux, puis les avons laissées proliférer en tant que myoblastes.
Une fois confluents, les myoblastes peuvent être différenciés dans un milieu pauvre en facteur de croissance. Environ 70 % des myoblastes fusionnent pour former de grandes cellules polynucléées appelées myotubes, tandis que les cellules restantes restent mononucléées et acquièrent des caractéristiques de cellules souches.
Ces cellules sont appelées CMRH et sont le pendant in vitro des cellules souches.
Elles partagent de nombreuses caractéristiques des CSM, comme par exemple leur état de quiescence, l’expression du facteur de transcription Pax7, ou encore leur capacité à être activées après stimulation [7].
Figure 1. A. Représentation schématique du processus de régénération in vivo. (1) Suite à une lésion, des signaux adaptés activent les cellules souches musculaires (CSM) et induisent leur migration vers le site de la lésion. Ces CSM activées ré-entrent dans le cycle cellulaire et sont appelées myoblastes. (2) Les myoblastes sur le site de la lésion prolifèrent jusqu’à atteindre un nombre approprié permettant la restauration du muscle endommagé. (3) Les myoblastes se différencient, arrêtent leur cycle cellulaire et entrent en phase post-mitotique. (4) Finalement, ils fusionnent entre eux ou avec la fibre endommagée pour restaurer l’intégralité du muscle. (5) En parallèle, pendant l’activation/prolifération des myoblastes, une sous-population reste quiescente et reconstitue le stock de CSM pour de futures régénérations.
B. Représentation schématique de notre modèle in vitro et photo représentative d’une culture de myotubes et MuRC après 48 heures de différenciation
ALTERNATIVES AU SÉRUM DE VEAU FŒTAL : LE PLASMA RICHE EN PLAQUETTES (PRP)
Une autre considération importante concerne les conditions de culture cellulaire utilisées pour l’expansion des cellules musculaires en laboratoire.
Traditionnellement, le sérum de bœuf fœtal (FBS) a été largement utilisé comme source de nutriments et de facteurs de croissance pour la culture cellulaire.
Cependant, l’utilisation du FBS présente des inconvénients, notamment des risques de contamination, d’immunogénicité et des préoccupations éthiques liées à son origine animale [8, 9, 10, 11].
Pour pallier ces problèmes, des alternatives au FBS sont activement recherchées. Le plasma riche en plaquettes (PRP) est l’une de ces alternatives potentielles.
Le PRP est un produit biologique dérivé du sang, riche en facteurs de croissance contenus dans les granules alpha des plaquettes.
Lorsqu’il est activé, le PRP libère ces facteurs de croissance, favorisant ainsi la régénération tissulaire.
Les différentes préparations de PRP comprennent le PRP riche en leucocytes (LR-PRP) et le PRP pauvre en leucocytes (LP-PRP), ainsi que le lysat plaquettaire qui sont des dérivés du PRP [12, 13, 14, 15, 16].
Des études préliminaires ont montré que le PRP, qu’il soit d’origine autologue ou allogénique, peut favoriser la prolifération de cellules in vitro.
Ces effets bénéfiques sont attribués aux facteurs de croissance contenus dans le PRP, tels que le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) [17, 18, 19, 20, 21].
Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour évaluer pleinement leur efficacité et leur sécurité, ainsi que pour résoudre les défis pratiques associés à leur utilisation à grande échelle dans un contexte clinique.
COMBINER LE PRP AVEC DE L’ACIDE HYALURONIQUE
L’acide hyaluronique (HA) est un composant essentiel de la matrice extracellulaire qui joue un rôle crucial dans divers processus biologiques, y compris la culture de cellules in vitro.
Son utilisation présente plusieurs avantages significatifs dans les cultures cellulaires, offrant un environnement propice à la croissance, à la différenciation et à la fonctionnalité des cellules [22].
L’un des principaux avantages de l’utilisation de l’acide hyaluronique dans les cultures de cellules in vitro est sa capacité à stimuler la prolifération cellulaire.
En fournissant un substrat tridimensionnel et une structure de soutien, l’acide hyaluronique crée un microenvironnement favorable à la croissance cellulaire, ce qui peut augmenter le taux de prolifération des cellules en culture [23].
De plus, l’acide hyaluronique aide à maintenir la viabilité des cellules en fournissant une hydratation adéquate et en régulant l’équilibre osmotique dans les cultures cellulaires.
Il agit comme un réservoir d’eau, retenant l’humidité nécessaire pour maintenir les cellules en bonne santé et fonctionnelles tout au long de la culture in vitro.
Un autre avantage majeur de l’utilisation de l’acide hyaluronique est sa capacité à améliorer l’adhésion cellulaire.
En fournissant des sites de liaison pour les récepteurs cellulaires spécifiques, il favorise l’attachement des cellules à la surface de culture, ce qui est essentiel pour leur survie, leur prolifération et leur différenciation appropriées [24].
Enfin, l’acide hyaluronique peut jouer un rôle dans la modulation de la différenciation cellulaire en influençant les interactions cellule-matrice et la signalisation cellulaire.
Des études ont montré que sa présence dans les cultures cellulaires peut favoriser la différenciation cellulaire dans certains types cellulaires, tels que les cellules souches mésenchymateuses, les chondrocytes et les adipocytes.
ÉTUDES FUTURES : ÉVALUATION DE L’EFFET DU PRP ET DU PRP-HA
Ainsi, dans le cadre de cette étude, nous prévoyons d’investiguer deux dérivés du sang humain (PRP humain allogénique non activé [PRP] ou PRP humain allogénique non activé combiné à l’acide hyaluronique [PRP-HA]), utilisés comme substituts de FBS pour l’expansion in vitro de myoblastes humains primaires avant leur différenciation myogénique.
Nous évaluerons le taux de prolifération in vitro, l’expression de différents marqueurs de surface cellulaire, leur capacité de différenciation myogénique et le niveau d’expression du facteur de transcription Pax7 dans les cellules réserves musculaires humaines générées in vitro.
Nous voulons tester si le PRP ou le PRP-HA peuvent efficacement remplacer le FBS xénogénique dans l’expansion in vitro de myoblastes humains, et si ces conditions de culture n’altèrent pas leur phénotype inflammatoire.
De plus, nous allons tester si les myoblastes humains, cultivés dans un milieu de croissance supplémenté au PRP ou au PRP-HA, génèrent un pourcentage plus élevé de cellules réserves Pax7High par rapport aux myoblastes traités au FBS.
Nos résultats préliminaires suggèrent fortement que le PRP humain allogénique non activé ou le PRP-HA sont des alternatives efficaces et appropriées au FBS pour la génération de cellules réserves musculaires humaines dans un état de quiescence plus profonde.
RÉFÉRENCES
- Relaix, P.S. Zammit, Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage, Development 139 (2012) 2845-56. https://doi.org/10.1242/dev.069088.
- A. Collins, I. Olsen, P.S. Zammit, L. Heslop, A. Petrie, T.A. Partridge, J.E. Morgan, Stem Cell Function, Self-Renewal, and Behavioral Heterogeneity of Cells from the Adult Muscle Satellite Cell Niche, Cell 122 (2005) 289-301. https://doi. org/10.1016/j.cell.2005.05.010.
- Fu, H. Wang, P. Hu, Stem cell activation in skeletal muscle regeneration, Cell. Mol. Life Sci. 72 (2015) 1663-77. https:// doi.org/10.1007/s00018-014-1819-5.
- Sun, C. Serra, G. Lee, K.R. Wagner, Stem cell-based therapies for Duchenne muscular dystrophy, Experimental Neurology 323 (2020) 113086. https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2019.113086.
- N. Judson, F.M.V. Rossi, Towards stem cell therapies for skeletal muscle repair, Npj Regen Med 5 (2020) 10. https:// doi.org/10.1038/s41536-020-0094-3.
- Lorant, C. Saury, C. Schleder, F. Robriquet, B. Lieubeau, E. Négroni, I. Leroux, L. Chabrand, S. Viau, C. Babarit, M. Ledevin, L. Dubreil, A. Hamel, A. Magot, C. Thorin, L. Guevel, B. Delorme, Y. Péréon, G. Butler-Browne, V. Mouly, K. Rouger, Skeletal Muscle Regenerative Potential of Human MuStem Cells following Transplantation into Injured Mice Muscle, Molecular Therapy 26 (2018) 618-33. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.10.013.
- Bouche, B. Borner, C. Richard, Y. Grand, D. Hannouche, T. Laumonier, In vitro-generated human muscle reserve cells are heterogeneous for Pax7 with distinct molecular states and metabolic profiles, Stem Cell Res Ther 14 (2023) 243. https://doi.org/10.1186/s13287-023-03483-5.
- E.A. Jochems, J.B.F. Van Der Valk, F.R. Stafleu, V. Baumans, The Use of Fetal Bovine Serum: Ethical or Scientific Problem?, Altern Lab Anim 30 (2002) 219-27. https://doi.org/10.1177/026119290203000208.
- Tekkatte, G.P. Gunasingh, K.M. Cherian, K. Sankaranarayanan, “Humanized” Stem Cell Culture Techniques: The Animal Serum Controversy, Stem Cells International 2011 (2011) 1-14. https://doi.org/10.4061/2011/504723.
- L. Spees, C.A. Gregory, H. Singh, H.A. Tucker, A. Peister, P.J. Lynch, S.-C. Hsu, J. Smith, D.J. Prockop, Internalized Antigens Must Be Removed to Prepare Hypoimmunogenic Mesenchymal Stem Cells for Cell and Gene Therapy, Molecular Therapy 9 (2004) 747-56. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2004.02.012.
- Karnieli, O.M. Friedner, J.G. Allickson, N. Zhang, S. Jung, D. Fiorentini, E. Abraham, S.S. Eaker, T.K. Yong, A. Chan,
- Griffiths, A.K. Wehn, S. Oh, O. Karnieli, A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies, Cytotherapy 19 (2017) 155-69. https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2016.11.011.
- R. Kark, J.M. Karp, J.E. Davies, Platelet releasate increases the proliferation and migration of bone marrow‐derived cells cultured under osteogenic conditions, Clinical Oral Implants Res 17 (2006) 321-7. https://doi. org/10.1111/j.1600-0501.2005.01189.x.
- Scully, P. Sfyri, S. Verpoorten, P. Papadopoulos, M.C. Muñoz‐Turrillas, R. Mitchell, A. Aburima, K. Patel, L. Gutiérrez,
K.M. Naseem, A. Matsakas, Platelet releasate promotes skeletal myogenesis by increasing muscle stem cell commitment to differentiation and accelerates muscle regeneration following acute injury, Acta Physiol 225 (2019). https://doi. org/10.1111/apha.13207.
- Mautner, G.A. Malanga, J. Smith, B. Shiple, V. Ibrahim, S. Sampson, J.E. Bowen, A Call for a Standard Classification System for Future Biologic Research: The Rationale for New PRP Nomenclature, PM&R 7 (2015) S53-9. https://doi. org/10.1016/j.pmrj.2015.02.005.
- M. DeLong, R.P. Russell, A.D. Mazzocca, Platelet-Rich Plasma: The PAW Classification System, Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery 28 (2012) 998-1009. https://doi.org/10.1016/j.arthro.2012.04.148.
- Burnouf, D. Strunk, M.B.C. Koh, K. Schallmoser, Human platelet lysate: Replacing fetal bovine serum as a gold standard for human cell propagation?, Biomaterials 76 (2016) 371-87. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.10.065.
- Dessels, M. Potgieter, M.S. Pepper, Making the Switch: Alternatives to Fetal Bovine Serum for Adipose-Derived Stromal Cell Expansion, Front. Cell Dev. Biol. 4 (2016). https://doi.org/10.3389/fcell.2016.00115.
- Patrikoski, M. Juntunen, S. Boucher, A. Campbell, M.C. Vemuri, B. Mannerström, S. Miettinen, Development of fully defined xeno-free culture system for the preparation and propagation of cell therapy-compliant human adipose stem cells, Stem Cell Res Ther 4 (2013) 27. https://doi.org/10.1186/scrt175.
- Shahdadfar, K. Frønsdal, T. Haug, F.P. Reinholt, J.E. Brinchmann, In Vitro Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells: Choice of Serum Is a Determinant of Cell Proliferation, Differentiation, Gene Expression, and Transcriptome Stability, STEM CELLS 23 (2005) 1357-66. https://doi.org/10.1634/stemcells.2005-0094.
- Lange, F. Cakiroglu, A.-N. Spiess, H. Cappallo-Obermann, J. Dierlamm, A.R. Zander, Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine, J. Cell. Physiol. 213 (2007) 18-26. https://doi.org/10.1002/jcp.21081.
- Levoux, A. Prola, P. Lafuste, M. Gervais, N. Chevallier, Z. Koumaiha, K. Kefi, L. Braud, A. Schmitt, A. Yacia, A. Schirmann, B. Hersant, M. Sid-Ahmed, S. Ben Larbi, K. Komrskova, J. Rohlena, F. Relaix, J. Neuzil, A.-M. Rodriguez, Platelets Facilitate the Wound-Healing Capability of Mesenchymal Stem Cells by Mitochondrial Transfer and Metabolic Reprogramming, Cell Metabolism 33 (2021) 283-99.e9. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.12.006.
- A. Burdick, G.D. Prestwich, Hyaluronic Acid Hydrogels for Biomedical Applications, Advanced Materials 23 (2011) H41– H56. https://doi.org/10.1002/adma.201003963.
- Abatangelo, V. Vindigni, G. Avruscio, L. Pandis, P. Brun, Hyaluronic Acid: Redefining Its Role, Cells 9 (2020) 1743. https://doi.org/10.3390/cells9071743.
- Lierova, J. Kasparova, A. Filipova, J. Cizkova, L. Pekarova, L. Korecka, N. Mannova, Z. Bilkova, Z. Sinkorova, Hyaluronic Acid: Known for Almost a Century, but Still in Vogue, Pharmaceutics 14 (2022) 838. https://doi.org/10.3390/ pharmaceutics14040838.
